使用Picus®電動(dòng)移液器、Safetyspace低吸附濾芯吸頭和濾芯吸頭。Picus®使用多次分液模式。移取Master Mix時(shí)，將電動(dòng)移液器速度參數(shù)設(shè)置為1。

qPCR準(zhǔn)備

qPCR準(zhǔn)備階段使用Picus®電動(dòng)移液器、Safetyspace濾芯吸頭及低吸附濾芯吸頭。Lo-Bind EP管用于DNA樣品制備及Master Mix的制備。制備用于所有測(cè)試的PCR Master Mix儲(chǔ)備液使用了MaximaSYBR Green qPCR Master Mix（不含ROX）、大腸桿菌uidA基因引物以及無(wú)核酸酶水。

用移液器將八個(gè) 15μL 的Master Mix重復(fù)樣品移取至PCR板孔中，用于各種測(cè)試條件。無(wú)模板對(duì)照（NTC）樣品不含大腸桿菌基因組DNA，并加入 5μL 無(wú)核酸酶水。用類似方法移取 5μL 含有1×106、1×105、1×104、1×103 以及1×102 個(gè)拷貝丨反應(yīng)大腸桿菌gDNA的系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。

在每個(gè)測(cè)試孔中有 5μL 含有1×103 個(gè)拷貝丨反應(yīng)的大腸桿菌gDNA。使用Picus® 電動(dòng)移液器的多次分液功能及低吸附濾芯吸頭以相同的方式將所有DNA樣本添加到PCR管中。使用LightCycler®480 qPCR儀進(jìn)行qPCR。循環(huán)參數(shù)如下：在 95°C下預(yù)培養(yǎng) 10 分鐘，隨后在 95°C 10 秒、55°C 10 秒、75°C 15 秒，75°C延伸 10 秒，40 次循環(huán)。

對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品、對(duì)照品和樣品中的SYBR綠色熒光激發(fā)進(jìn)行定量。使用LightCycler® 480軟件確定定量循環(huán)（Cq）值和實(shí)際拷貝數(shù)，并使用MS Excel分析結(jié)果。

數(shù)據(jù)分析

Cq值的百分比系統(tǒng)誤差（%S）反映了處理Master Mix的儀器系統(tǒng)（移液器和吸頭系統(tǒng)）Cq值的誤差。移液過(guò)程中的隨機(jī)誤差是結(jié)果精準(zhǔn)度的測(cè)量，反映了實(shí)驗(yàn)中重復(fù)樣品之間的差異。Cq值的百分比隨機(jī)誤差（%R）反映了結(jié)果的重現(xiàn)性，并且可能受到實(shí)驗(yàn)人員移液操作的影響。

基于PCR原理的實(shí)驗(yàn)中使用電動(dòng)移液器移取Master Mix可確保高準(zhǔn)確度和精準(zhǔn)度。此外，電動(dòng)移液器可加快完成實(shí)驗(yàn)的速度，減少移液所需的時(shí)間，使操作更符合人體工程學(xué)。因此，使用電動(dòng)移液器可以降低實(shí)驗(yàn)室工作人員患上重復(fù)性勞損（RSI）的可能性，并使實(shí)驗(yàn)更不容易出錯(cuò)，它還能在相同的實(shí)驗(yàn)中使用更少的移液器吸頭，因此也是更環(huán)保的選擇。